Достижения и особенности в работе с древней ДНК и ДНК из сложных криминалистических образцов (Фрагмент)

Выявление контаминации

Возможная контаминация в исследованиях древней ДНК может быть выявлена с большей надежностью, когда при анализе априорно предполагается, что экстракт будет контаминирован, и результаты каждого этапа рассматриваются с точки зрения такой возможной. Для выявления лабораторной контаминации используются т.н. «пустые» экстракции – образцы, которые подвергают таким же процедурам, что и обрабатываемый образец, однако не добавляют материал образца или ДНК. Так как посторонние матрицы могут быть представлены в очень низких концентрациях, проявляясь не в каждой реакции, ставят множественные контроли в отношении 1:5, но не менее чем 1:1 с экстрагируемым образцом. Такие «пустые» экстракты используют далее на всех этапах анализа в дополнение к обычным негативным контролям.

Независимое воспроизведение результатов другой лабораторией считается одним из наиболее сильных аргументов, подтверждающим аутентичность результатов. Однако и оно не является абсолютной гарантией [36].

Особое внимание следует уделять биоинформационному анализу полученных нуклеотидных последовательностей. Так как наиболее часто при исследовании древ- них образцов проводится анализ митохондриальной ДНК (мтДНК), необходимо проводить сравнение полученных последовательностей не только с мтДНК видов, близких к исследуемому, или с мтДНК человека (как возможного источника контаминации), но также и с ядерными гомологами мтДНК (nuclear mtDNAs, numts), уровень сходства которых с мтДНК у человека достигает 98 % (например, для последовательности NT _004350.18, расположенной на хромосоме 1).

Химические модификации древней ДНК и постмортальные мутации

Рис. 2. Пример продуктов ЦПР-амплификации фрагментов митохондриального генома мамонта: а – продукты ЦПР-амплификации коротких фрагментов (300–600 п.н.); б – ПЦР-амплификация длинных фрагментов, содержащих полные митохондриальные гены (1317 п.н. для гена CytB и 1613 п.н. для гена ATP6), ПЦР-фрагменты большего размера (3054 п.н. для гена ND5) получить не удалось. М – маркер, размер указан в т.п.н. К – негативные контроли [13]

Постмортальные изменения ДНК и мутации, происходящие при ее амплификации in vitro, являются одной из центральных методологических проблем, присущих исследованиям древней ДНК, как и ДНК из образцов, сложных для криминалистической экспертизы. В отличие от метаболически активных тканей, в которых функционируют системы репарации ДНК, в мертвых или спящих клетках накапливаются химические (гидролитические или оксидативные) модификации и разрушения нитей ДНК. Как показывают исследо- вания, постмортальные разрушения ДНК характеризуются разрывами нитей, утратой оснований, а также сшивками между нитями, препятствующими ПЦР. Особенно важными постмортальными изменениями являются химические модификации оснований, не препятствующие амплификации, но приводящие к включению во вновь синтезированную нить нуклеотидов, не соответствующих исходно при- сутствовавшим в немодифицированной нити ДНК (замены типа I A ? G / T ? C и замены типа II C ? T / G ? A) (табл. 2).

Характер разрушения деградированных матриц ДНК зависит от возраста образцов, их географической локализации и тафономических условий (условий захоронения останков) той среды, из которых останки были извлечены. Постмортальные изменения могут возникать в «горячих точках» мутирования, имитируя тем самым эволюционный процесс [37]. Характер и динамика накопления постмортальных разрушений в ДНК продолжают исследоваться [38, 39]. Вследствие разрушения ДНК размер большинства фрагментов в древних образцах не превышает 100–500 п.н. Поэтому при проведении ПЦР на древней ДНК подбираются праймеры для амплификации фрагментов не более 200–300 п.н., хотя в отдельных случаях могут быть получены фрагменты и большей длины (рис. 2).

Таблица 2. Различные типы разрушений в древней ДНК (по [4, 17] с изменениями)

Рис. 3. Распределение размера секвенированных фрагментов при секвенировании на платформе 454. Неопубликованные данные, получены в сотрудничестве E.И. Рогаева с M. Blow и E. Rubin

Большинство исследований древней ДНК проведено на мтДНК, которая содержится в клетке в количестве сотен и тысяч копий, и с вероятностью большей, чем ядерная ДНК, может быть успешно амплифицирована. Исследований ядерной ДНК намного меньше. Для оценки сохранности ядерной ДНК из образца мамонта M. Primigenius, найденного в вечной мерзлоте на Чукотке, были проведены амплификация, клонирование и секвенирование ядерной ДНК (Е.И. Рогаев, Э. Рубин, неопубликованные данные). Большая часть последовательностей генома была представлена фрагментами по 50–100 нуклеотидов (рис. 3). Это свидетельствует об относительно хорошей сохранности ядерной ДНК.

Постмортальные модификации случайным образом распределены в сохранившихся фрагментах ДНК. Так, в исследовании [13] при клонировании ПЦР-амплификатов мтДНК мамонта и последующем секвенировании были обнаружены однонуклеотидные замены в отдельных фрагментах со средней частотой 6 на 1000 нуклеотидов. Это обстоятельство было учтено для точной реконструкции полной последовательности митохондриального генома чукотского мамонта M. primigenius (рис. 4) как консенсуса многократно перекрывающихся фрагментов [13]. Для дополнительного контроля постмортальных мутаций во всех генах мтДНК мамонта были определены общее число замен по сравнению с мтДНК слона E. maximus и отношение несинонимичных (ведущих к замене аминокислоты) к синонимичным заменам. При этом число замен в генах мтДНК чукотского мамонта [13] оказалось меньше, чем в генах одновременно опубликованной немецкими коллегами последовательности мтДНК мамонта, найденного в Якутии [40]. Сравнительный анализ показал, что это различие обуcловлено необычайно большим количеством замен на участке в 200–300 нуклеотидов в мтДНК якутского мамонта, в области генов ND1 и ND2, при этом число неси- нонимических замен превышало число синонимических – 2:1 для гена ND1 и 7:2 для гена ND2. В гене ND2 чукотского мамонта была выявлена лишь одна синонимическая замена, а в гене ND1 отличий от гена слона найдено не было [13]. Недетектированные постмортальные мутации сказываются на результатах филогенетической реконструкции.

Новые технологии секвенирования ДНК

При исследованиях древней ДНК приходится секвенировать большое количество коротких фрагментов, многократно перекрывающих одни и те же участки генома. Низкая скорость и высокая стоимость секвенирования ограничивала возможности таких исследований. В последние 3–4 года стали доступны новые технологии массивного параллельного секвенирования ДНК, что снизило стоимость секвенирования ДНК на два порядка. Новые технологии позволяют исследователю иметь в своем распоряжении секвенирующие мощности, доступные ранее лишь крупным геномным центрам. Среди новых стратегий секвенирования применение в области исследований древней ДНК нашли технологии клональной амплификации с последующим параллельным секвенированием плотных микропанелей клонированных фрагментов ДНК в повторяющихся циклах энзиматических реакций с компьютерной регистрацией результирующих сигналов для каждого отдельного фрагмента в каждом цикле. Упорядоченное расположение в пространстве ПЦР- ампликонов на плоской подложке или их иммобилизация на бусинах микронного размера, которые помещаются в упорядоченные ячейки, позволяет минимизировать объем реакционной смеси, что значительно удешевляет процесс.

Реализация этих стратегий включает несколько этапов, на каждом из которых найдены свои технические решения. Так, при подготовке библиотек фрагментов ДНК с помощью ПЦР количественное соотношение продуктов амплификации не пропорционально количественному соотношению исходных матриц – некоторые фрагменты ДНК амплифицируются более эффективно, тогда как другие малоактивны при амплификации и в результате теряются. Преодолеть эту проблему позволяет эмульсионная ПЦР. Раствор ДНК вводят в смесь минеральных масел с таким расчетом, чтобы каждая молекула оказалась в собственном пузырьке, в котором, как в микрореакторе, проходит ее амплификация. Этот подход позволяет минимизировать потери отдельных исходных матриц. Существуют различные технические решения как для под- готовки библиотек фрагментов, так и для других этапов процесса – энзиматических реакций, визуализации и компьютерной регистрации сигнала, хранения и обработки данных [41].

Новые возможности технологий секвенирования сочетаются с определенными ограничениями. Так, массивное параллельное пиросеквенирование, реализуемое платформой 454 Life Science system (Genome Sequence 20tm DNA sequencing System: GS20, Roche/454 Life Science), позволяет в 100 раз быстрее проводить секвенирование, чем стандартный метод с использованием капиллярного электрофореза – за один раз анализируется до 25 млн нуклеотидов. Однако при этом читается последовательность небольшой длины (обычно менее 250–400 п.н.). Собственно, в применении к древней ДНК это не является ограничением, т.к. анализировать приходится множество фрагментов как раз такого размера.

Технология Illumina, ранее называвшаяся Solexa (по названию разработавшей ее компании), и SOLid (компания ABI) позволяют анализировать до 1 млрд нуклеотидов за один проход, но читаются лишь последовательности длиной 30–40 нуклеотидов (год назад было всего 25). Наличие полных последовательностей геномов человека и основных модельных организмов, используемых как референтные последовательности, позволяет картировать короткие прочтенные фрагменты и собирать их в единую последовательность.

Еще одним ограничением применения новых платформ является 10-кратное снижение точности секвенирования по сравнению с методами, основанными на принципе Сэнгера. Однако эти технологии весьма перспективны, и можно ожидать, что они будут усовершенствованы в ближайшем будущем.