Страсти по молодому мозазавру

Дьявол в деталях...

Людвиг Мис Ван Дер Роэ 

Егор Севостьянов: Ярослав Кузьмин и Булат Хасанов противоречат друг другу! Как такое может быть?

а) Ярослав Кузьмин пишет, что после очистки осталось 258 мг органики.

б) Булат Хасанов пишет, что весь коллаген костей растворился на первой стадии подготовки.

Почему они противоречат-то друг другу? Или там помимо коллагена ещё и другая органика была?

Ярослав Кузьмин: Думаю, противоречия в комментарии Б. Хасанова и моем нет. "Коллаген" в моем комментарии следует понимать и просто как "органика", но что это такое точно - и сами авторы не знают. Что это органика - почти не вызывает сомнений, или же это (что трудно представить, т.к. образец был подвергнут химической очистке) неорганический углерод. Можно строить  различные предположения, но главная проблема - недостаток информации в исходной работе (что само по себе плохо, т.к. осталось масса вопросов, на которые нет ответа, а они напрямую связаны с темой статьи о возможном сохранении протеина в течение десятков миллионов лет).

Булат Хасанов: Да, там была другая органика. Как я уже отмечал, для проведения радиоуглеродного анализа исследуемой кости был выбран такой метод выделения органического вещества, в ходе которого весь коллаген полностью растворился. Тут уместно вспомнить суп. Для хорошего супа надо взять мясо с костью и варить несколько часов. За это время в раствор переходит довольно значительное количество коллагена, который и придаёт бульону густоту, навар! В кислой среде этот процесс происходит значительно интенсивнее, а при подготовке к датированию фрагмент кости держали при температуре 80 °С в 2 % растворе соляной кислоты двенадцать часов. После чего раствор слили, а для датировки использовали твёрдый осадок.

Что же всё-таки датировали? Тут следует напомнить, что для радиоуглеродного анализа важно, чтобы датируемый объект представлял собой закрытую систему. В такой системе углеродный обмен происходит только до какого-то момента, после чего прекращается. Вот именно этот момент прекращения обмена и датируется. В обсуждаемом случае это должна была бы быть гибель животного. Представляет ли исследуемая кость закрытую систему? Конечно, нет! Кость – это пористое тело. Пока она лежит во вмещающих отложениях, внутри неё происходят разнообразные процессы, от бактериальной активности до диффузии растворов с посторонней органикой извне. И происходят до тех пор, пока кость не попадёт к исследователям. Другое дело, коллаген этой кости. Вот он действительно идеальная закрытая система. Молекулы коллагена могут распадаться на меньшие фрагменты, но внедрить в них посторонний углерод невозможно.

Как мы помним, в случае с обсуждаемой костью коллаген как раз удалили, а для датирования использовали нечто, не растворившееся ни в соляной кислоте, ни в щёлочи. Более того, это нечто сохранялось в кости многие тысячелетия. Я не берусь судить, что это было, однако у авторов работы есть свои предположения. И здесь мы переходим к следующему вопросу. 

Егор Севостьянов: Ярослав Кузьмин пишет, что возраст даёт бактериальное вещество. Однако авторы явно указывают, что они не выделили ни БАКТЕРИАЛЬНЫХ БЕЛКОВ, ни ГОПАНОИДОВ (бактериальные маркеры). Почему Кузьмин делает такие выводы-то?

Радиоуглеродный анализ показал наличие С-14 сопоставимое с возрастом в 24600 лет. Совокупность остальных анализов показала отсутствие маркеров бактериального загрязнения (гопаноиды и бактериальные белки). Очень странно, когда такие выводы как у вас читаешь. На чём они основаны, если не секрет? Неужели только на том, что "этого не может быть, потому как не может быть". Такой подход догматизмом отдаёт, к сожалению...

Булат Хасанов:  Приведём цитату из обсуждаемой статьи:

Likewise, the amount of finite carbon was exceedingly small, corresponding to 4.68%±0.1 of modern 14C activity (yielding an age of 24 600 BP), and most likely reflect bacterial activity near the outer surface of the bone (although no bacterial proteins or hopanoids were detected, one bacterial DNA sequence was amplified by PCR, and microscopic clusters of bone-boring cyanobacteria were seen in places along the perimeter of the diaphyseal cortex).

Вот она же в моём вольном переводе:

Также, количество полученного углерода было очень мало, а его активность соответствовала 4.68%±0.1 активности современного 14C (что даёт возраст 24 600 лет назад). Этот углерод, скорее всего, происходит вследствие бактериальной активности вблизи внешней поверхности кости (хотя ни бактериальных белков, ни гопаноидов не обнаружили, одна бактериальная последовательность ДНК была размножена в ходе PCR, а микроскопические кластеры разрушающих кости цианобактерий были замечены в некоторых местах по периметру компактной части диафиза). 

Честно говоря, к этому мне нечего добавить. 

Что касается отсутствия бактериальных белков, то они ведь тоже не современные. Они бог знает сколько времени провели в этой кости. Та датировка, которая в результате получилась, - это усреднённая дата по всей органике, выделенной неким способом. А накапливалась эта органика не один день. Думаю, поэтому и нет белков.

Егор Севостьянов: я немного почитал здесь и пришёл к замешательству... Вот (допустим) работа. 

В этой работе для человеческих костей методом 14С определяют возраст 7680 ± 45 лет. Для очистки применяют метод AAA (acid-alkali-acid), а именно "procedure, using 4% HCl at a temperature of 80 °C, followed by 4% NaOH at 20–80 °C, and again 4% HCl at 80 °C".

Но мы то знаем (!) "кость – это пористое тело. Пока она лежит во вмещающих отложениях, внутри неё происходят разнообразные процессы, от бактериальной активности до диффузии растворов с посторонней органикой извне. И происходят до тех пор, пока кость не попадёт к исследователям. Другое дело, коллаген этой кости. Вот он действительно идеальная закрытая система. Молекулы коллагена могут распадаться на меньшие фрагменты, но внедрить в них посторонний углерод невозможно.

Как мы помним, в случае с обсуждаемой костью коллаген как раз удалили, а для датирования использовали нечто, не растворившееся ни в соляной кислоте, ни в щёлочи. Более того, это нечто сохранялось в кости многие тысячелетия."

что же выходит-то? этим костям человека на самом деле не 7000 лет, а миллионы? Скажите, правильно ли я понял Булата Хасанова и мы действительно не можем всерьёз рассматривать журналы, публикующие статьи с очисткой костей методом ААА?

Булат Хасанов: Как хорошо, что дискуссию на Вашем форуме ведут такие въедливые и внимательные читатели. Интерес к нашей науке не может не радовать. Вот мой ответ:

В процитированной статье сказано:

“The larger samples of wood, peat, and an animal bone (elk) were dated conventionally by liquid scintillation counting in Moscow (laboratory code GIN) and St. Petersburg (laboratory code LE). The samples were pretreated by the standard AAA (acid-alkali-acid) procedure, using 4% HCl at a temperature of 80 °C, followed by 4% NaOH at 20-80 °C, and again 4% HCl at 80 °C (Mook and Streurman 1983; Zaretskaya et al. 2005).”

Здесь есть небольшая тонкость. В этом абзаце авторы статьи говорят не о своих датировках, а о тех, что были опубликованы ранее, поэтому они не описали всю методику подробно, а ограничились ссылками на методическую работу (Mook and Streurman 1983) и оригинальное исследование (Zaretskaya et al. 2005). Посмотрим на него (http://www.geochronometria.pl/pdf/geo_24/Geo24_16.pdf):

Radiocarbon dating of all samples was performed in the Radiocarbon division of the Laboratory for Isotope Geochemistry and Geochronology, Geological Institute of Ras (GIN- index). Pre-treatment A-B-A or A-BI-BII-A procedures for peat, gyttja, organic silt, charcoal, and wood samples are thoroughly described in the articles of Zaretskaya et al. (2001a; 2001b; 2002). Bone pre-treatment is recited by Dr Sulerzhitsky (Sulerzhitsky, 1997; Sulerzhitsky and Romanenko, 1999).

Напомню, на всякий случай, что аббревиатура ААА (acid-alkali-acid) соответствует АВА (acid-base-acid). Здесь чётко и ясно сказано, что для древесины и торфа одна методика, для костей -- другая. Разберёмся в деталях. Во всех случаях нам надо избавиться от постороннего по отношению к образцу углерода. Для этого используется трёхступенчатый процесс: сначала обрабатываем образец соляной кислотой (растворяем карбонаты), затем щёлочью (растворяем гуминовые кислоты, попавшие в образец из почвы), затем опять соляной кислотой, чтобы избавиться от углерода, попавшего в образец с углекислым газом во время обработки щёлочью. НО: основное вещество древесины и торфа -- целлюлоза. Она почти не растворяется в горячих растворах кислот и щелочей, поэтому смело нагреваем растворы.

С костями по-другому. Поскольку коллаген хорошо растворяется при высокой температуре, а нам его надо сохранить, проводим первый этап при пониженной температуре, например в холодильнике. Мы и в этом случае добиваемся растворения неорганических солей, но делаем это не так интенсивно, сохраняя коллаген. Потом следует обработка щёлочью и ещё раз кислотой, опять же нежная. Кстати, если образец большой, и нам не страшны потери коллагена, можно особенно не церемониться и мириться с потерями, выигрывая во времени обработки.

Если для древесины и торфа трёхступенчатой обработки ААА достаточно, то для костей нужен ещё один, последний этап. Наш образец представляет собой уже довольно чистый коллаген, но для большей надёжности его растворяют в слабокислом растворе при высокой температуре и центрифугируют, чтобы дополнительно очистить раствор от твёрдых частиц. Если вспомнить, с чего эта дискуссия началась, то именно на этой стадии происходит разделение на собственно коллаген, и то самое нечто, что выделили из костей динозавра!

Описанная методика выделения коллагена была предложена Р. Лонжином в 1970 году и в последствии несколько видоизменялась. Теперь о методике датирования костей человека в обсуждаемой работе. Читаем: 

Тhe small samples of bone were dated by AMS in Groningen (laboratory code GrA). From the bone samples, collagen was extracted as a datable fraction in Groningenusing a modernized version of the Longin method (Longin 1970).

Вот, для этих костей использовали метод Р. Лонжина!, т. е. в обоих случаях (и рог лося, и кости человека) датировали именно коллаген. Наверное этих вопросов бы не возникло, если бы авторы чуть подробнее изложили методику. С другой стороны, они привели все ссылки, пройдя по которым можно составить себе исчерпывающее представление о том, что они собственно делали. 

Егор Севостьянов: Уважаемый Булат Хасанов, можете дать ссылку на литературу с критикой применения метода ААА для выделения коллагена? Потому как вот на этом сайте  предлагается методика выделения коллагена с помощью соляной кислоты при температуре110°C. Ко всему прочему утверждается, что коллаген в горячей соляной кислоте переходит в желатин. Не сделали ли Вы поспешные выводы для сайта антропогенез, так как всё же кажется странным, чтобы ни 12 соавторов, ни рецензенты журнала не обратили внимания, что они используют методику для выделения из кости целлюлозы, а не коллагена. 

Булат Хасанов: На сайте, ссылку на который вы любезно прислали, читаем:

Bone pretreatment. Bone samples are mechanically cleaned, reduced to ~2 mm and smaller fragments and repeatedly washed by sonication in fresh ultrapure water (UPW) until the water remains clear. The cleaned material demineralized in dilute HCl. The resultant insoluble protein residue (commonly, "collagen") is isolated by centrifugation and rinsed in UPW until the pH is greater than 4. The collagen is denatured into gelatin in 0.01 N HCl at 58 to 60 °C. If high molecular weight humate contamination is suspected, it is removed by hydrolyzing the gelatin in 6 N HCl at 110 °C and slowly forcing the hydrolyzate through a chromatographic column of XAD-2 resin. The high molecular weight fraction of the gelatin is isolated by ultrafiltration (30 kDa MWCO) and dried for analysis.

Т. е. сначала кость очищается от минеральных солей, которые содержат углерод. Поскольку в кислой среде коллаген растворяется, это делается деликатно, чтобы избежать потерь. Из текста можно понять, что лаборатория использует для этого слабый раствор солянки. Температура не указана, но рискну предположить, что на этой стадии они пробирки не нагревают! Потом они берут нерастворившийся остаток кости и подвергают дальнейшей обработке. Она заключается в нагревании этого остатка в слабом растворе соляной кислоты. При этом коллаген растворяется. Можно сказать и так: переходит в желатин. Важно, что для последующего анализа используется именно этот раствор. Именно раствор они в некоторых случаях нагревают до 110 градусов и прогоняют через хроматографическую колонку. В случае же метода АВА, раствор выбрасывается, а для датирования берут осадок. Кстати, на этом же сайте читаем:

Acid-base-acid (ABA). The ABA treatment of organic materials (plant remains, charcoal, peat, wood) is employed by every radiocarbon laboratory in the world. At Aeon, the ABA treatment consists of the following steps: и т. д.

Т. е. метод АВА используется для датирования растительных остатков, древесных углей, торфа и древесины. Ещё раз: оба метода (и тот, что для костей, и АВА) принципиально сходны. Разница в том, что берут для датирования: раствор коллагена (он же желатин) или осадок. Когда датировали динозавра, взяли осадок, в котором коллагена уже не было.

Что касается авторов, давайте уже спросим у них, что они имели в виду, выбирая такую методику. Наверное, им и в голову не приходило датировать коллаген кости, которой много миллионов лет. Поэтому они решили продатировать заведомо постороннюю по отношению к кости органику. Я думаю так.

У меня сложилось впечатление, что авторы сделали всё, до чего смогли дотянуться. Радиоуглерод тут был просто одной из доступных возможностей, какого-то глубокого смысла в привлечении этого метода, по-моему, не было. Зато сколько он вызвал вопросов! Может быть, так и надо - вставлять что-нибудь этакое в текст для привлечения внимания?

Материалы по теме:

• Исходная статья в PLOS One
• Первая публикация на АНТРОПОГЕНЕЗ.РУ о радиоуглеродном анализе мозазавра
• Дискуссия Вконтакте